Rekombinantná dna: opis, charakteristika

Rekombinantná DNA je molekula vytvorená laboratórnymi metódami genetickej rekombinácie na kombináciu genetického materiálu z viacerých zdrojov. Je to možné, pretože molekuly DNA všetkých organizmov majú rovnakú chemickú štruktúru a líšia sa iba nukleotidovou sekvenciou v nej.

Vytvorenie

Molekulárne klonovanie je laboratórny proces používaný na vytvorenie rekombinantnej DNA. Toto je jedna z dvoch najpoužívanejších metód spolu s polymerázovou reťazovou reakciou (PCR). Umožňuje vám kontrolovať replikáciu akejkoľvek špecifickej sekvencie DNA vybranej experimentátorom.

Medzi technikami rekombinantnej DNA existujú dva základné rozdiely. Jedným z nich je, že molekulárne klonovanie zahŕňa replikáciu v živej bunke a PCR v skúmavke. Ďalším rozdielom je, že prvá metóda umožňuje rezanie a vkladanie sekvencií DNA, zatiaľ čo druhá je vylepšená kopírovaním existujúcej sekvencie.

Vektor DNA

Získanie rekombinantnej DNA vyžaduje Klonovací vektor. Pochádza z plazmidov alebo vírusov a je relatívne malým segmentom. Výber vektora pre molekulárne klonovanie závisí od výberu hostiteľského organizmu, veľkosti klonovanej DNA a od toho, či by sa mali exprimovať cudzie molekuly. Segmenty je možné kombinovať pomocou rôznych metód,ako je klonovanie reštrikcií / ligáz alebo Gibsonova zostava.

Klonovanie

V štandardných protokoloch klonovanie zahŕňa sedem krokov.

1. Výber hostiteľského organizmu a klonovacieho vektora.
2. Získanie vektora DNA.
3. Tvorba klonovanej DNA.
4. Vytvorenie rekombinantnej DNA.
5. Jeho zavedenie do tela hostiteľa.
6. Výber organizmov, ktoré ho obsahujú.
7. Výber klonov s požadovanými vložkami DNA a biologickými vlastnosťami.

Po transplantácii do hostiteľského tela môžu alebo nemusia byť exprimované cudzie molekuly obsiahnuté v rekombinantnej štruktúre. Expresia vyžaduje reštrukturalizáciu génov, aby zahŕňala sekvencie, ktoré sú potrebné na produkciu DNA. Používa ho translačný aparát hostiteľa.

Ako to funguje

Rekombinantná DNA funguje, keď hostiteľská bunka exprimuje proteín z rekombinantných génov. Expresia závisí od prostredia génu so súborom signálov, ktoré poskytujú pokyny na jeho transkripciu. Medzi ne patrí promótor, väzba ribozómov a Terminátor.

Problémy nastanú, ak gén obsahuje intróny alebo signály, ktoré pôsobia ako terminátory pre bakteriálneho hostiteľa. To vedie k predčasnému ukončeniu. Rekombinantný proteín a môžu byť nesprávne spracované, zložené alebo rozložené. Jeho produkcia v eukaryotických systémoch sa zvyčajne vyskytuje v kvasinkách a vláknitých hubách. Používanie klietok pre zvieratá je ťažké kvôli tomu, že veľa ľudí potrebuje silný podporný povrch.

Vlastnosti organizmov

Organizmy obsahujúce molekuly rekombinantnej DNA majú jasne normálne fenotypy. Ich vzhľad, správanie a metabolizmus sa zvyčajne nemenia. Jediným spôsobom, ako demonštrovať prítomnosť rekombinantných sekvencií, je preskúmať samotnú DNA pomocou testu polymerázovej reťazovej reakcie.

V niektorých prípadoch môže mať rekombinantná DNA škodlivé účinky. To sa môže stať, keď sa jeho fragment obsahujúci Aktívny promótor nachádza vedľa predtým Tichého génu hostiteľskej bunky.

Používať

Technológia rekombinantnej DNA je široko používaná v biotechnológii, medicíne a výskume. Jeho bielkoviny a ďalšie produkty nájdete takmer v každej západnej lekárni, veterinárnej klinike, ordinácii lekára, lekárskom alebo biologickom laboratóriu.

Najbežnejšou aplikáciou je základný výskum, v ktorom je technológia dôležitá pre najmodernejšiu prácu v biologických a biomedicínskych vedách. Rekombinantná DNA sa používa na identifikáciu, mapovanie a sekvenciu génov, ako aj na určenie ich funkcie. sondy rDNA sa používajú na analýzu génovej expresie v jednotlivých bunkách a v tkanivách celých organizmov. Rekombinantné proteíny sa používajú ako činidlá v laboratórnych experimentoch. Niektoré konkrétne príklady sú uvedené nižšie.

Rekombinantný chymozín

Chymozín, ktorý sa nachádza v syridle, je enzým, potrebné pre výroba syrov. Bola to prvá geneticky modifikovaná potravinárska prídavná látka používaná v priemysle. Mikrobiologicky vyrobený rekombinantný enzým, štrukturálne identický s enzýmom získaným z teľaťa, je lacnejší a vyrába sa vo veľkých množstvách.

Rekombinantný ľudský inzulín

Takmer úplne nahradil inzulín získaný zo živočíšnych zdrojov( napríklad ošípaných a hovädzieho dobytka) na liečbu cukrovky závislej od inzulínu. Rekombinantný inzulín sa syntetizuje zavedením génu ľudského inzulínu do baktérií rodu Etherichia alebo kvasiniek.

Rastový Hormón

Je predpísaný pacientom, ktorých hypofýza generuje nedostatočné množstvo rastového hormónu na udržujte normálny vývoj. Predtým, ako bol k dispozícii rekombinantný rastový hormón, bol získaný z hypofýzy mŕtvol. Táto nebezpečná prax viedla k tomu, že u niektorých pacientov sa vyvinula Creutzfeld-Jakobova choroba.

Rekombinantný faktor zrážania krvi

Toto je proteín zrážania krvi, ktorý sa podáva pacientom s formami hemofílie s poruchami zrážania krvi. Nie sú schopné produkovať faktor VIII v dostatočnom množstve. Pred vývojom rekombinantného faktora VIII sa proteín získal spracovaním veľkého množstva ľudskej krvi od niekoľkých darcov. To prinieslo veľmi vysoké riziko prenosu infekčných chorôb.

Diagnóza infekcie HIV

Každá z troch široko používaných metód diagnostiky infekcie HIV bola vyvinutá pomocou rekombinantnej DNA. Test protilátok využíva jej proteín. Určuje prítomnosť genetického materiálu HIV pomocou reverznej transkripčnej polymerázovej reťazovej reakcie. Vývoj testu bol umožnený molekulárnym klonovaním a analýzou sekvencie genómov HIV.