Rekombinantný proteín: spôsoby prípravy a aplikácie

Proteín je dôležitou súčasťou všetkých organizmov. Každá z jeho molekúl pozostáva z jedného alebo viacerých polypeptidových reťazcov pozostávajúcich z aminokyselín. Hoci informácie potrebné pre život sú kódované DNA alebo RNA, rekombinantné proteíny vykonávajú širokú škálu biologických funkcií funkcie v organizmoch, vrátane enzymatickej katalýzy, ochrany, podpory, pohybu a regulácie. Podľa ich funkcií v tele môžu byť tieto látky rozdelené do rôznych kategórií, ako sú protilátky, enzýmy, štruktúrna zložka. Vzhľadom na dôležité funkcie boli tieto zlúčeniny intenzívne študované a široko používané.

V minulosti bol hlavným spôsobom získania rekombinantného proteínu jeho izolácia od prírodného zdroja, ktorý je spravidla neefektívny a časovo náročný. Nedávny pokrok v biologických molekulárnych technológiách umožnil klonovať DNA kódujúcu špecifický súbor látok do expresného vektora látok, ako sú baktérie, kvasinky, bunky hmyzu a cicavce.

Jednoducho povedané, rekombinantné proteíny sú preložené exogénnymi produktmi DNA v živých bunkách. Ich výroba zvyčajne obsahuje dve hlavné etapy:

1. Klonovanie molekuly.
2. Proteínová expresia.

V súčasnosti je výroba takejto štruktúry jednou z najsilnejších metód používaných v medicíne a biológii. Kompozícia je široko používaná vo výskume a biotechnológiách.

Lekárske smerovanie

Rekombinantné proteíny poskytujú dôležité liečba bunky rôznych chorôb, ako je cukrovka, rakovina, infekčné choroby, hemofília a anémia. Bežné formulácie takýchto látok zahŕňajú protilátky, hormóny, interleukíny, enzýmy a antikoagulanciá. Rastie potreba rekombinantných formulácií na terapeutické použitie. Umožňujú rozšíriť liečebné metódy.

rekombinantné proteíny získané genetickým inžinierstvom zohrávajú kľúčovú úlohu na trhu terapeutických liekov. V súčasnosti sa väčšina terapeutických látok vyrába v bunkách cicavcov, pretože ich zloženie je schopné produkovať vysoko kvalitné látky podobné prírodným. Okrem toho sa v E. coli vyrába veľa schválených rekombinantných terapeutických proteínov vďaka dobrej genetike, rýchlemu rastu a vysoko produktívnej produkcii. Má tiež pozitívny vplyv na vývoj liekov založených na tejto látke.

Vykonávanie výskumu

Produkcia rekombinantných proteínov je založená na rôznych metódach. Látky pomáhajú zistiť základné a základné princípy tela. Tieto molekuly sa môžu použiť na identifikáciu a určenie umiestnenia látky kódovanej špecifickým génom a na odhalenie funkcií iných génov v rôznych bunkových aktivitách, ako je bunková signalizácia, metabolizmus, rast, replikácia a smrť, transkripcia, translácia a modifikácia kompozícií uvažovaných vo výrobku.

Skúmaná kompozícia sa teda často používa v molekulárnej biológii, bunkovej biológii, biochémii, štrukturálnom a biofyzikálnom výskume a mnohých ďalších oblastiach vedy. Produkcia rekombinantných proteínov má zároveň medzinárodnú prax.

Takéto zlúčeniny sú užitočnými nástrojmi na pochopenie medzibunkových interakcií. Preukázali svoju účinnosť v niekoľkých laboratórnych metódach, ako je ELISA a imunohistochémia (IHC). Rekombinantné proteíny sa môžu použiť na vývoj enzýmových testov. Pri použití v kombinácii s párom zodpovedajúcich protilátok môžu byť bunky použité ako štandardy pre aplikáciu nových technológií.

Biotechnológia

Rekombinantné proteíny obsahujúce aminokyselinovú sekvenciu sa používajú aj v priemysle, výrobe potravín, poľnohospodárstve a bioinžinierstve. Napríklad v chove zvierat sa do potravín môžu pridávať enzýmy na zvýšenie nutričnej hodnoty kŕmnych zložiek, zníženie nákladov a odpadu a podporu zdravie zvieracích čriev, zlepšiť výkon a zlepšiť prostredie.

Okrem toho sa baktérie mliečneho kvasenia (LAB) už dlho používajú na výrobu fermentovaných potravín a nedávno bola vyvinutá LAB na expresiu rekombinantných proteínov obsahujúcich aminokyselinovú sekvenciu, ktorá sa môže široko používať napríklad na zlepšenie ľudského trávenia, zvierat a výživy.

Takéto látky však majú aj obmedzenia:

1. V niektorých prípadoch je výroba rekombinantných proteínov zložitá, nákladná a časovo náročná.
2. Látky produkované v bunkách sa nemusia zhodovať s prírodnými formami. Tento rozdiel môže znížiť účinnosť terapeutických rekombinantných proteínov a dokonca spôsobiť vedľajšie účinky. Okrem toho môže tento rozdiel ovplyvniť výsledky experimentov.
3. Hlavným problémom všetkých rekombinantných liekov je imunogenicita. Všetky biotechnologické lieky môžu vykazovať určitú formu imunogenicity. Je ťažké predpovedať bezpečnosť nových terapeutických proteínov.

Vo všeobecnosti sa pokrok v biotechnológii zvýšil a uľahčil produkciu rekombinantných proteínov pre rôzne aplikácie. Aj keď majú stále určité nevýhody, látky sú dôležité v medicíne, výskume a biotechnológiách.

Spojenie s chorobami

rekombinantný proteín nespôsobuje žiadne škody na ľuďoch. Je to len neoddeliteľná súčasť spoločnej molekuly pri vývoji špecifického liečiva alebo potravinového prvku. Mnoho lekárskych štúdií ukázalo, že nútená expresia proteínu FGFBP3 (skrátene BP3) v laboratórnom kmeni obéznych myší preukázala významné zníženie ich tukovej hmoty napriek genetickej predispozícii na použitie.

Výsledky takýchto experimentov ukazujú, že proteín FGFBP3 môže ponúknuť novú terapiu na odstránenie porúch spojených s metabolickým syndrómom, ako je cukrovka 2. typu a obezita pečene. Ale keďže BP3 je prírodný proteín a nie umelé liečivo, klinické skúšky rekombinantného ľudského BP3 sa môžu začať po poslednom kole predklinických štúdií. Na, to znamená, že dôvody súvisiace s bezpečnosťou vykonávania takýchto štúdií. Rekombinantný proteín to tiež nepoškodzuje ľudí kvôli jeho postupnému spracovaniu a čisteniu. Zmeny sa vyskytujú aj na molekulárnej úrovni.

PD-L2, jeden z kľúčových hráčov v imunoterapii, bol nominovaný na Nobelovu cenu za fyziológiu alebo medicínu za rok 2018. Túto prácu začal profesor James P. Allison z USA a profesor Tasuku Honjo z Japonska viedli k liečbe rakoviny, ako je melanóm, rakovina pľúc a ďalšie, na základe imunoterapie kontrolným bodom. Spoločnosť AMSBIO nedávno pridala do svojej rady imunoterapie nový dôležitý produkt - aktivátor Pd - L2 / Tcr-cho rekombinantná bunková línia.

V experimentoch na testovanie konceptu vedci z University of Alabama v Birminghame pod vedením MD X.Long Zheng, Profesor Robert B. Adams a riaditeľ oddelenia laboratórnej medicíny na Katedre patológie na Lekárskej fakulte UAB zdôraznili potenciálnu terapiu zriedkavej, ale smrteľnej poruchy zrážania krvi, TTP.

Výsledky tejto štúdie po prvýkrát ukazujú, že transfúzia krvných doštičiek nabitých rADAMTS13 môže byť novým a potenciálne účinným terapeutickým prístupom k arteriálnej trombóze spojenej s vrodeným a imuno-sprostredkovaným TTP.

Rekombinantný proteín nie je len živina, ale aj liečivo v zložení vyvíjaného liečiva. Toto je len niekoľko oblastí, ktoré sa v súčasnosti zaoberajú medicínou a súvisia so štúdiom všetkých jej štruktúrnych prvkov. Ako ukazuje medzinárodná prax, štruktúra látky umožňuje riešiť mnohé vážne problémy v ľudskom tele na molekulárnej úrovni.

Vývoj vakcín

Rekombinantný proteín je špecifická sada molekúl, ktoré je možné modelovať. Podobná vlastnosť sa používa aj pri vývoji vakcín. Nová stratégia očkovania, známa tiež ako použitie špeciálnej rekombinantnej vírusovej injekcie, by mohla poskytnúť ochranu miliónom kurčiat, ktorým hrozí vážne ochorenie dýchacích ciest, uviedli vedci z University of Edinburgh a Pirbright Institute. Tieto vakcíny používajú neškodné alebo slabé verzie vírusu alebo baktérie na vstreknite mikróby do buniek tela. V tomto prípade odborníci použili ako vakcíny rekombinantné vírusy s rôznymi špičkovými proteínmi na vytvorenie dvoch verzií neškodného vírusu. Existuje mnoho rôznych liek postavené na tomto spojení.

Rekombinantný proteín má nasledujúce obchodné názvy a analógy:

1. "Fortelizin".
2. "Zaltrap".
3. "Eilea".

Sú to hlavne protinádorové lieky, ale s touto účinnou látkou sú spojené aj ďalšie oblasti liečby.

Podľa novej štúdie publikovanej vo vedeckom časopise Nature Communications nová vakcína, nazývaná tiež LASSARAB, určená na ochranu ľudí pred horúčkou Lassa aj besnotou, preukázala sľubné výsledky v predklinických štúdiách. Kandidát na inaktivovanú rekombinantnú vakcínu používa oslabený vírus besnoty.

Výskumný tím vložil genetický materiál vírusu Lassa do vektora vírusu besnoty tak, aby vakcína exprimovala povrchové proteíny v bunkách Lassa aj besnoty. Tieto povrchové zlúčeniny spôsobujú imunitnú odpoveď proti infekčným agensom. Potom bola takáto vakcína inaktivovaná ,aby" zničila " použitý živý vírus besnoty aby sa dopravca.

Spôsoby získania

Existuje niekoľko systémov výroby látok. Všeobecná metóda získavania rekombinantného proteínu je založená na získavaní biologického materiálu zo syntézy. Existujú však aj iné spôsoby.

V súčasnosti existuje päť hlavných výrazových systémov:

1. Expresný systém E. Coli.
2. Systém expresie kvasiniek.
3. Systém expresie buniek hmyzu.
4. Systém expresie buniek cicavcov.
5. Bezbunkový proteínový expresný systém.

Druhá možnosť je zvlášť vhodná na expresiu transmembránových proteínov a toxických zlúčenín. V posledných rokoch sa látky, ktoré sa ťažko exprimujú konvenčnými intracelulárnymi metódami, úspešne integrovali do buniek in vitro. V Bielorusku sa široko používa výroba rekombinantných proteínov. Existuje niekoľko štátnych podnikov, ktoré sa zaoberajú touto otázkou.

Systém syntézy proteínov bez buniek je rýchla a účinná metóda syntézy cieľových látok pridaním rôznych substrátov a energetických kompozícií potrebných na transkripciu a transláciu v enzýmovom systéme bunkových extraktov. V posledných rokoch výhody bezbunkových metód takýchto typov látok, ako sa postupne objavili zložité, toxická membrána, ktorá demonštruje ich potenciálnu aplikáciu v biofarmaceutickej oblasti.

Bezbunková technológia môže ľahko a kontrolovateľne pridávať rôzne neprirodzene sa vyskytujúce aminokyseliny, aby sa dosiahli zložité modifikačné procesy, ktoré je ťažké vyriešiť po konvenčnej rekombinantnej expresii. Takéto metódy majú vysokú aplikačnú hodnotu a potenciál pre dodávanie liekov a vývoj vakcín pomocou častíc podobných vírusu. Veľké množstvo membránových proteínov bolo úspešne exprimovaných vo voľných bunkách.

Expresia zlúčenín

Rekombinantný proteín CFP10-ESAT 6 sa vyrába a používa na výrobu vakcín. Takýto alergén na tuberkulózu vám umožňuje posilniť imunitný systém a vyvinúť protilátky. Molekulárny výskum vo všeobecnosti zahŕňa štúdium akéhokoľvek aspektu proteínu, ako je štruktúra, funkcia, modifikácie, lokalizácia alebo interakcie. Na preskúmanie toho, ako konkrétne látky regulujú vnútorné procesy, vedci zvyčajne potrebujú prostriedky na výrobu funkčných zlúčenín, ktoré sú zaujímavé a prospešné.

Vzhľadom na veľkosť a zložitosť proteínov nie je chemická syntéza pre toto úsilie životaschopnou možnosťou. Namiesto toho sa živé bunky a ich bunkové mechanizmy zvyčajne používajú ako továrne na vytváranie a konštrukciu látok na základe poskytnutých genetických šablón. Systém expresie rekombinantných proteínov ďalej rozvíja potrebnú štruktúru na vytvorenie liečiva. Ďalej potrebné materiál je vybraný pre rôzne kategórie liekov.

Na rozdiel od proteínov sa DNA ľahko konštruuje synteticky alebo in vitro pomocou osvedčených rekombinantných metód. V dôsledku toho môžu byť DNA matice špecifických génov, s alebo bez pridaných reportérových sekvencií alebo sekvencií afinitných značiek, konštruované ako matice pre expresiu skúmanej látky. Takéto kompozície získané z takýchto matríc DNA sa nazývajú rekombinantné proteíny.

Tradičné stratégie expresie látky zahŕňajú transfekciu buniek pomocou vektora DNA, ktorý obsahuje matricu, a následnú kultiváciu buniek tak, aby prepisovali a prekladali požadovaný proteín. Typicky sa bunky potom lyzujú, aby sa extrahovala exprimovaná kompozícia na následné čistenie. Rekombinantný proteín CFP10-ESAT6 sa spracováva týmto spôsobom a prechádza purifikačným systémom z možnej tvorby toxínov. Až potom vstúpi do vakcíny na syntézu.

Prokaryotické aj eukaryotické in vivo systémy expresie molekulárnych látok sú široko používané. Výber systému závisí od typu proteínu, požiadaviek na funkčnú aktivitu a požadovaného výťažku. Tieto expresné systémy zahŕňajú cicavce, hmyz, kvasinky, baktérie, riasy a bunky. Každý systém má svoje vlastné výhody a problémy a výber správneho systému pre konkrétnu aplikáciu je dôležitý pre úspešné vyjadrenie látky preskúmanej v článku.

Vyjadrenie z cicavcov

Použitie rekombinantných proteínov umožňuje vývoj vakcín a liekov rôznych úrovní. Na tento účel je možné použiť tento spôsob získania látky. Cicavčie expresné systémy sa môžu použiť na výrobu proteínov zo sveta zvierat, ktoré majú vďaka svojmu fyziologicky relevantnému prostrediu najprirodzenejšiu štruktúru a aktivitu. To vedie k vysokej úrovni posttranslačného spracovania a funkčnej aktivity. Cicavčie expresné systémy sa môžu použiť na produkciu protilátok, komplexných proteínov a zlúčenín na použitie v bunkových funkčných testoch. Tieto výhody sa však spájajú s tvrdšími kultúrnymi podmienkami.

Cicavčie expresné systémy sa môžu použiť na dočasnú produkciu proteínov alebo prostredníctvom stabilných bunkových línií, kde je expresný konštrukt integrovaný do hostiteľského genómu. Zatiaľ čo takéto systémy môžu byť použité v niekoľkých experimentoch, Dočasná výroba môže generovať veľké množstvo látky za jeden až dva týždne. Biotechnológia rekombinantných proteínov tohto typu je veľmi žiadaná.

Tieto prechodné, vysoko produktívne expresné systémy cicavcov používajú suspenzné kultúry a môžu poskytnúť gramy na liter. Okrem toho majú tieto proteíny viac natívnych skladacích a posttranslačných modifikácií, ako je glykozylácia, v porovnaní s iný expresné systémy.

Vyjadrenie z hmyzu

Metódy výroby rekombinantných proteínov sa neobmedzujú iba na cicavce. Existujú aj produktívnejšie spôsoby, pokiaľ ide o výrobné náklady, hoci výťažok látky na 1 liter upravenej kvapaliny je oveľa nižší.

Bunky hmyzu sa môžu použiť na expresiu proteínov na vysokej úrovni s modifikáciami podobnými systémom cicavcov. Existuje niekoľko systémov, ktoré sa môžu použiť na výrobu rekombinantného baculovírusu, ktorý sa potom môže použiť na extrakciu látky, ktorá je predmetom záujmu v bunkách hmyzu.

Expresiu rekombinantných proteínov je možné ľahko rozšíriť a prispôsobiť suspenznej kultúre s vysokou hustotou na veľkovýrobu molekúl zlúčenín. Funkčnejšie sa podobajú natívnemu zloženiu hmoty cicavcov. Aj keď výťažok môže byť až 500 mg / l, produkcia rekombinantného baculovírusu môže trvať dlho a kultivačné podmienky sú zložitejšie ako prokaryotické systémy. V južnejších a teplejších krajinách sa však táto metóda považuje za účinnejšiu.

Bakteriálna expresia

Produkciu rekombinantných proteínov je možné stanoviť aj pomocou baktérií. Táto technológia sa výrazne líši od tých, ktoré sú opísané vyššie. Bakteriálne proteínové expresné systémy sú populárne, pretože baktérie sa ľahko kultivujú, rýchlo rastú a poskytujú vysoké výnosy rekombinantného zloženia. Eukaryotické látky s viacerými doménami exprimované v baktériách sú však často nefunkčné, pretože bunky nie sú vybavené na vykonávanie potrebných posttranslačných modifikácií alebo molekulárneho skladania.

Okrem toho sa mnohé proteíny stávajú nerozpustnými vo forme inklúznych molekúl, ktoré sú veľmi je ťažké obnoviť bez tuhých denaturátorov a následných ťažkopádnych postupov opätovného tvarovania molekulárneho zloženia. Táto metóda sa z väčšej časti stále považuje za prevažne experimentálnu.

Expresia bez buniek

Rekombinantný proteín obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu stafylokinázy sa získa trochu iným spôsobom. Je súčasťou mnohých typov injekcií, ktoré pred použitím vyžadujú niekoľko systémov.

Expresia bezbunkového proteínu je syntéza látky in vitro pomocou extraktov z celých buniek kompatibilných s transláciou. Extrakty z celých buniek v zásade obsahujú všetky makromolekuly a zložky, potrebné pre prepis, preklad a dokonca aj posttranslačná modifikácia.

Tieto zložky zahŕňajú RNA polymerázu, regulačné proteínové faktory, transkripčné formy, ribozómy a tRNA. Pridaním kofaktorov, nukleotidov a špecifickej génovej matrice môžu tieto extrakty syntetizovať proteíny, ktoré sú predmetom záujmu, za niekoľko hodín.

Aj keď nie sú udržateľné pre veľkovýrobu, systémy bez buniek alebo in vitro proteínovej expresie (IVT) majú oproti tradičným systémom in vivo množstvo výhod.

Bezbunková expresia umožňuje rýchlu syntézu rekombinantných zlúčenín bez zapojenia bunkovej kultúry. Bezbunkové systémy umožňujú označovať proteíny modifikovanými aminokyselinami, ako aj exprimovať zlúčeniny, ktoré podliehajú rýchlej proteolytickej degradácii intracelulárnymi proteázami. Okrem toho je pomocou bezbunkovej metódy ľahšie exprimovať mnoho rôznych proteínov súčasne (napríklad testovať proteínové mutácie exprimáciou v malom meradle z mnohých rôznych rekombinantných dna matríc). V tomto reprezentatívnom experimente bol na expresiu proteínu kaspázy-3 u ľudí použitý systém IVT.

Závery a vyhliadky do budúcnosti

Produkciu rekombinantného proteínu možno teraz považovať za zrelú disciplínu. Je to výsledok mnohých postupných zlepšení v čistení a analýze. V súčasnosti sa programy na objavovanie liekov zriedka zastavujú kvôli neschopnosti produkovať cieľový proteín. Paralelné procesy expresie, čistenia a analýzy niekoľkých rekombinantných látok sú dnes dobre známe v mnohých laboratóriách po celom svete.

Proteínové komplexy a rastúci úspech pri vytváraní solubilizovaných membránových štruktúr si budú vyžadovať viac zmien, aby držali krok s dopytom. Vznik efektívnych zmluvných výskumných organizácií pre pravidelnejší prísun bielkovín umožní prerozdeliť zdroje vedy na riešenie týchto nových problémov.

Okrem toho by paralelné pracovné postupy mali umožniť vytvorenie kompletných knižníc skúmanej látky s cieľom umožniť identifikáciu nových cieľov a lepší skríning spolu s tradičnými projektmi detekcie liekov s malými molekulami.