Prietoková cytofluorimetria - podstata a aplikácia

Prietoková cytofluorimetria je cytologická metóda výskumu, používa sa na hĺbkovú analýzu buniek. Jeho výhodou je, že vám umožňuje študovať každú bunku samostatne. Tento typ analýzy pomáha vyhodnotiť niekoľko parametrov v stovkách buniek v priebehu niekoľkých sekúnd. Z tohto dôvodu je cytofluorimetria považovaná za jednu z najrýchlejších a najpresnejších metód analýzy, ktoré sú v súčasnosti k dispozícii vedcom a klinickým lekárom.

Zásada

Princíp metódy prietokovej cytofluorimetrie je založený na meraní rozptylu svetla a luminiscencie (fluorescencie) buniek. Bunková suspenzia prechádza vo forme prúdu vysokou rýchlosťou cez bunku cytometra, kde sa ožaruje laserom. Vykonáva sa tam aj takzvané hydrodynamické zaostrovanie. Jeho mechanizmus spočíva v tom, že tok z bunky so študovanými časticami na výstupe prúdi do vonkajšieho prúdu, ktorý má vyššiu rýchlosť. Výsledkom je, že častice sú usporiadané v usporiadanom reťazci.

Bunky sú vopred označené špeciálnymi fluorescenčnými farbivami (fluorochrómy). Vďaka nim laserový lúč vzrušuje sekundárnu žiaru. Prijaté svetelné signály sú zaznamenávané detektormi. Následne sa informácie spracúvajú pomocou softvérových algoritmov, ktoré vám umožňujú počítať jednotlivé populácie buniek, ktoré sa líšia podľa akýchkoľvek kritérií.

Vyšetrenie pomocou tradičnej mikroskopie vám často neumožňuje rozlíšiť rôzne bunky, pretože vyzerajú rovnako. Cytofluorimetria môže poskytnúť ďalšie údaje (integrita štruktúry DNA), analyzovať expresiu proteínov, prežitie buniek.

Pretože na excitáciu fluorochrómov sú potrebné svetelné lúče s rôznymi vlnovými dĺžkami, ako aj rôzne typy detektorov, moderné inštalácie sú vybavené niekoľkými detekčnými kanálmi (od 4 do 30). Počet laserových žiaričov môže byť od 1 do 7. Zložitejšie zariadenia umožňujú multiparametrické štúdie niekoľkých vlastností častíc.

Výhody a nevýhody

Výhody prietokovej cytofluorimetrie zahŕňajú nasledujúce:

• vysoká rýchlosť spracovania (registrácia až 30 tisíc udalostí za 1 sekundu);
• možnosť študovať veľké množstvo buniek (až 100 miliónov. vo vzorke);
• kvantitatívne hodnotenie intenzity fluorescenčného žiarenia;
• analýza každej z buniek;
• súčasné skúmanie heterogénnych procesov;
• automatické oddelenie údajov podľa populácií buniek;
• okamžite kvalitatívna vizualizácia výsledkov.

Ďalšou vlastnosťou tejto technológie je, že analyzovaná častica môže byť zafarbená niekoľkými fluorescenčnými roztokmi. Vďaka tomu sa uskutočňuje multiparametrická štúdia.

Medzi nevýhody patrí zložitosť technického vybavenia a potreba špeciálnej prípravy vzoriek.

Cytometre

Prvé zariadenia tohto typu sa objavili už v roku 1968 v Nemecku, ale rozšírili sa oveľa neskôr. V súčasnosti možno všetky zariadenia pracujúce metódou prietokovej cytofluorometrie rozdeliť do 2 typov:

• zariadenia, ktoré merajú fluorescenčné žiarenie (dve alebo viac vlnových dĺžok), rozptyl svetla pod uhlom 10 a 90° (detektor malého uhla a bočného rozptylu);
• zariadenia, ktoré okrem merania viacerých bunkových parametrov automaticky triedia do skupín podľa týchto kritérií.

Detektor priameho rozptylu svetla je určený na určenie veľkosti bunky a zariadenie na registráciu laterálneho rozptylu svetla vám umožňuje získať informácie o prítomnosti intracelulárnych granúl, objemovom pomere cytoplazmy a jadra.

Klasické cytometre, na rozdiel od svetelných mikroskopov, neumožňujú získať obraz bunky. V posledných rokoch však boli vyvinuté kombinované zariadenia, ktoré sú schopné kombinovať schopnosti mikroskopu a cytofluorimetra. Budeme o nich hovoriť nižšie.

Vizualizácia cytometrov

Jedna vlastnosť je charakteristická pre zariadenia používané v klasickej prietokovej cytofluorometrii: ak sú v populácii analyzovaných buniek zaznamenané zriedkavé udalosti, potom neexistuje spôsob, ako posúdiť, aká je ich podstata. Tieto častice sa môžu ukázať ako zvyšky mŕtvych buniek alebo ich vzácna skupina. V konvenčných zariadeniach sú takéto údaje vylúčené zo všeobecného toku udalostí, ale môžu mať osobitnú hodnotu pre vedeckú a klinickú analýzu.

Vizualizačné prietokové cytometre novej generácie vám umožňujú zachytiť obraz každej bunky prechádzajúcej v toku cez zónu detektora. Je ľahké ho vidieť kliknutím na príslušnú oblasť diagramu, ktorá sa zobrazuje na monitore počítača.

Oblasti použitia

Prietoková cytofluorometria je univerzálna metóda, ktorý sa používa v mnohých oblastiach medicíny a vedy:

• imunológia;
• onkológia;
• transplantológia (transplantácia červenej kostnej drene, kmeňových buniek);
• hematológia;
• toxikológia;
• biochémia (meranie kyslosti vo vnútri bunky, štúdium ďalších parametrov);
• farmakológia (tvorba nových liekov);
• mikrobiológia;
• parazitológia a virológia;
• oceánológia (štúdium fytoplanktónu na posúdenie stavu nádrží a iných úloh);
• nanotechnológia a analýza mikročastíc.

Imunológia

Ľudský imunitný systém pozostáva z veľkého počtu rôznych buniek. Prietoková cytofluorimetria v imunológii umožňuje vyhodnotiť ich štruktúru a funkcie, to znamená vykonať morfofunkčnú analýzu.

Takéto štúdie pomáhajú študovať komplexnú povahu imunity. Fenotypy buniek sa menia v dôsledku aktivácie antigénmi, vývoja patológií a ďalších faktorov. Cytofluorimetria môže oddeliť subpopulácie imunitných buniek v komplexnej zmesi a vyhodnotiť všetky ich zmeny v dynamike.

Onkológia

Jednou z najdôležitejších úloh v onkológii je diferenciácia buniek podľa ich typu. Princíp analýzy metódou prietokovej cytofluorimetrie v hematológii je založený na nasledujúcom fenoméne: pri spracovaní vzorky špeciálnym fluorescenčným farbivom sa viaže na cytoplazmatické proteíny. Po rozdelení v aktívne proliferujúcich bunkách sa jeho obsah zníži na polovicu. V súlade s tým intenzita žiarenia buniek klesá dvojnásobne.

Existujú aj iné spôsoby identifikácie proliferujúcich buniek:

• použitie farbív viažucich DNA (propídiumjodid);
• aplikácia označeného uracilu;
• registrácia zvýšenej hladiny expresie cyklínových proteínov, ktoré sa podieľajú na regulácii bunkového cyklu.