Aplikácia voges-proscauerovej reakcie na mikrobiologickú diferenciáciu enterobaktérií

Voges-Proskauerova reakcia zaujíma osobitné miesto v diferenciálnom stanovení enterobaktérií a niektorých vibrácií. Test je založený na schopnosti baktérií fermentovať glukózu za vzniku acetoínu.

Podstata výskumného procesu

V mikrobiológii sa Voges-Proskauerova reakcia často používa na diferenciáciu v rámci rodiny enterobaktérií a yersinií (vrátane patogénov pseudotuberkulózy a enterokolitov), E. coli, aeróby tvoriace spóry. Výsledok je vizualizovaný v dôsledku farebného sfarbenia média pridaním určitých činidiel.

Tento test patrí do série IMViC (skratka Indol, metyl Red, Voges-Proskauer I citrát) - skupina identifikačných testov, ktoré zahŕňajú diferenciálne definície:

• s indolom založeným na štiepení tryptofánu na indol, ktorý sa používa v prítomnosti činidla Kovacs alebo Ehrlich;
• použitie metylrotu alebo metylčervenej, ktorá detekuje dané pH v dôsledku metabolizmu glukózy;
• Voges-Proscauerove reakcie na detekciu acetyl-metylkarbinolu;
• využitie citrátu s zmena farby v dôsledku alkalizácie média.

Podstatou procesu je vizualizácia prítomnosti diagnostikovaných baktérií v dôsledku interakcie acetoínu, ktorý tvoria, s žieravým draslíkom v prítomnosti kyslíka. Acetyl-metylkarbinol sa oxiduje na diacetyl, ktorý tvorí zlúčeninu jasne červenej alebo ružovej farby. Citlivosť testu sa zvyšuje zavedením alfa-naftolu pred zavedením hydroxidu draselného.

Nastavenie testu

Formulácia reakcie Voges-Proskauer zahŕňa predbežnú kultiváciu mikroorganizmov. Čistá kultúra sa vysieva na Clarkovo diferenciálne diagnostické médium, ktorého variáciou je Clarkov vývar (bez pridania agaru-agaru). Používa sa buď hotové médium alebo samo pripravené médium. Zloženie zahŕňa:

• 5 g peptónu;
• 5 g glukózy;
• 5 g dvojsýtneho fosforečnanu draselného;
• 1 l destilátu.

Počas štúdie sa kultúra naočkuje sterilnou bakteriologickou slučkou do kvapalného média. Množstvo-5 ml v skúmavke plus kontrola. Inkubácia sa uskutočňuje pri teplote 35-37 stupňov počas dvoch dní. Ďalej sa Voges-Proskauerova reakcia študuje postupne:

1. 2,5 ml kultúry v bujóne sa prenesie do sterilnej skúmavky.
2. Pridajte šesť kvapiek alfa-naftolu (5% roztok alkoholu).
3. Pridajte 40% roztok hydroxidu draselného v množstve 0,1 ml alebo dve kvapky.
4. Miešanie sa vykonáva jemným pretrepaním skúmavky.
5. Výsledok sa vyhodnotí po 15 minútach od začiatku experimentu.

Alternatívnou metódou vykonania testu je nočná inkubácia, ktorej čas sa skracuje na 18 hodín alebo až na jeden deň. Okrem tejto metódy sa používa aj expresný test: kultúra sa zavedie do slučky v 2 ml média, inkubuje sa asi štyri hodiny, potom sa pridajú činidlá v rovnakom množstve 2-3 kvapiek, zmiešajú sa a výsledok sa vyhodnotí za desať minút.

Kontrola je jedným z patogénov pneumónie Klebsiella pneumoniae-kmeň atcc 13883.

Vyhodnotenie výsledku

Po uplynutí požadovaného času po pridaní činidiel (od 5 do 15 minút) by sa mala pozorovať čerešňovo-červená farba s výraznou pozitívnou reakciou, červená a ružová - so slabou pozitívnou reakciou. Absencia zmien je zaznamenaná ako negatívny výsledok.

Nadbytok žieravého draslíka v roztoku môže napodobniť pozitívnu reakciu a zafarbiť ju farbou medi. V tomto prípade by sa mala zaznamenať negatívna odpoveď testovanej kolónie. Farbenie medi sa objavuje aj v prípadoch, keď sa hodnotenie podáva hodinu po zavedení činidiel.

Pri hodnotení výsledku je potrebné vziať do úvahy, že dlhodobá kultivácia študovaných mikroorganizmov (počas troch dní) vedie k okysleniu média, čo môže viesť k nesprávnemu výsledku štúdie. Reakcia môže byť slabo vyjadrená pozitívna alebo falošne negatívna.

Požiadavky na reagencie na skúšku

Reagencie pre Voges-Proskauerovu reakciu musia spĺňať požiadavky, ako napríklad, ako správne koncentrácia, vysoký stupeň čistenia a stability, ktorý sa dosahuje dodržiavaním pravidiel skladovania.

Hotové testovacie súpravy zvyčajne obsahujú činidlá pre 100 alebo viac aplikácií a sú v plastových alebo tmavých sklenených liekovkách. Kvalita je regulovaná príslušnou dokumentáciou.